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轉(zhuǎn)自羅氏診斷生命科學(xué)公眾號(hào)
大家好，本堂課小羅將跟大家分享數(shù)字PCR之“分”而治之納米微孔對(duì)dPCR定量結(jié)果的影響。
1999年 “數(shù)字PCR”（Digital PCR，dPCR）的概念被第一次提出，至今已有十幾年的時(shí)間。現(xiàn)如今大多數(shù)科學(xué)工作者對(duì)數(shù)字PCR的概念已不再陌生。就其本質(zhì)，可以歸結(jié)為“分而治之”（divide and conquer）【1】：通過將一份qPCR體系分配成大量納米微孔之后，再進(jìn)行單獨(dú)、平行的PCR擴(kuò)增。由于每個(gè)納米微孔中包含或者不包含目標(biāo)分子（DNA模板），因此在PCR擴(kuò)增結(jié)束后，通過對(duì)每個(gè)納米微孔熒光信號(hào)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系中模板分子的絕對(duì)定量。
dPCR是“分而治之”的過程，“分”是技術(shù)關(guān)鍵，而分成多少個(gè)納米微孔正是困擾實(shí)驗(yàn)者的首要問題。
應(yīng)該分成多少個(gè)納米微孔？
首先需要明確納米微孔的數(shù)量
是如何影響dPCR的定量結(jié)果。
dPCR采用直接計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行定量分析，即在PCR擴(kuò)增結(jié)束后，將有熒光信號(hào)的納米微孔記為1，無熒光信號(hào)記為0（定量是二進(jìn)制的，因此稱為“數(shù)字”）。有熒光信號(hào)的微孔說明至少含有一個(gè)拷貝的目標(biāo)分子。在目標(biāo)DNA濃度極低的情況下，理論上可以認(rèn)為有熒光的納米微孔數(shù)目就等于DNA分子的拷貝數(shù)，但通常情況下，數(shù)字PCR的納米微孔中可能會(huì)包含兩個(gè)甚至更多的目標(biāo)分子，因此需要采用泊松概率分布公式來進(jìn)行計(jì)算：
λ = −ln (1 − p)
λ：每個(gè)微孔的目標(biāo)分子的平均數(shù)量
p：具有正信號(hào)的納米微孔數(shù)量與微孔總數(shù)的比值。
可以使用λ計(jì)算出目標(biāo)分子的絕對(duì)數(shù)量【2】，很明顯，微孔數(shù)越多，檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍就越廣【3】。
圖1的泊松概率分布曲線圖更直觀地體現(xiàn)了這一點(diǎn)：
圖1. 由微孔預(yù)測(cè)目標(biāo)分子數(shù)
（圖片來源：羅氏診斷整理）
如圖1顯示，隨著陽性微孔比例（p）的增加，體系中目標(biāo)分子的平均拷貝數(shù)會(huì)有較大的差距，隨著p的持續(xù)增加，dPCR結(jié)果的不確定度也隨著提高。總體來說，dPCR陽性微孔數(shù)量不得超過總微孔數(shù)量的80%，總反應(yīng)微孔數(shù)的增加提高的是dPCR檢測(cè)的線性范圍。
在傳統(tǒng)模擬分析中，測(cè)量的不確定度通常受檢測(cè)儀器分辨率的限制，例如，熒光檢測(cè)器分辨熒光信號(hào)微小差異的能力。但在dPCR 檢測(cè)中，檢測(cè)儀器只需要識(shí)別每個(gè)納米微孔是否有0個(gè)或大于1個(gè)目標(biāo)分子，因此dPCR的數(shù)據(jù)分析較少依賴于檢測(cè)器的特性。排除了檢測(cè)器對(duì)dPCR定量結(jié)果的影響，那么下一個(gè)需要明確的信息是什么呢？
需要明確的是
引起dPCR偏差的來源有哪些。
dPCR主要有2個(gè)引起偏差的來源，分別是：二次采樣誤差和分區(qū)誤差。二次采樣過程引入了不可避免的誤差源，尤其是當(dāng)原始樣本中要檢測(cè)的目標(biāo)很少時(shí)，設(shè)定了檢測(cè)下限，儀器本身能兼容的二次采樣體積越大，一定程度上能提高檢測(cè)的靈敏度。
根據(jù)泊松分布原理，陽性微孔比例不超過80%，所以分區(qū)誤差在原始樣本濃度較高的情況下占主導(dǎo)地位。在一組重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，若信號(hào)為0的微孔數(shù)量存在差異，該差異會(huì)引起總反應(yīng)體系中目標(biāo)結(jié)果計(jì)算的差異。根據(jù) Dube 等人的分析，可以找到對(duì)分區(qū)誤差的計(jì)算方式【4】【5】，根據(jù)該計(jì)算方式我們可以比較不同納米微孔數(shù)量下的分區(qū)誤差【6】。
圖2比較了20,000個(gè)微孔和1,000,000個(gè)微孔的二次采樣和分區(qū)誤差與樣本濃度的關(guān)系。在dPCR中，通常將每個(gè)納米微孔中的模板拷貝數(shù)λ的范圍調(diào)整到0.001到6【4】（在某些情況下，可以高達(dá)8【7】）。在納米微孔N為1,000,000時(shí)，分區(qū)錯(cuò)誤顯著下降到<3%，說明微孔數(shù)量越多，越能降低分區(qū)誤差，從而提高dPCR的檢測(cè)準(zhǔn)確度。
圖2 . ( A ) 20,000 個(gè)分區(qū)和 ( B ) 1,000,000個(gè)微孔的
二次采樣和分區(qū)誤差與樣本濃度的關(guān)系
（圖片來源：羅氏診斷整理）
由dPCR定量的原理分析得出，“分”成的納米微孔數(shù)量與定量結(jié)果的準(zhǔn)確性和檢測(cè)范圍緊密相關(guān)，總結(jié)下來就是：微孔越多，dPCR結(jié)果越準(zhǔn)確，動(dòng)態(tài)范圍越廣。
雖然現(xiàn)有數(shù)字PCR系統(tǒng)在實(shí)踐中采用稀釋樣品的方式來避免微孔不夠的問題，但這也限制了數(shù)字PCR的實(shí)際性能。因?yàn)楦嗟姆謪^(qū)數(shù)量才能檢測(cè)到更多的野生型核酸，從而才能檢出更低頻率的變異。
參考文獻(xiàn)：
1. M Baker nature methods |VOL.9 NO.6 |JUNE 2012 | 541-544
2. Brunstein J (2013) Digital PCR: theory and applications. MLO Med Lab Obs 45:34–35
3. Hindson BJ, Ness KD, Masquelier DA et al (2011) High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem 83:8604–8610
4. Bizouarn, F. In Quantitative Real-Time PCR; Biassoni, R., Raso, A., Eds.; Methods in Molecular Biology; Springer: New York, 2014; Vol. 1160, pp 27–41.
5. Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. Mathematical Analysis of Copy Number Variation in a DNA Sample Using Digital PCR on a Nanofluidic Device. PLoS One 2008, 3 (8), e2876.
6. Digital Assays Part I: Partitioning Statistics and Digital PCR，Vol 22, Issue 4, 2017
7. Morley, A. A. Digital PCR: A brief history. Biomol. Detect. Quantif. 2014, 1 (1), 1–2.
*僅用于科學(xué)研究，不用于臨床診斷。TE-CN-00454有效期至2024年12月8日。
